Utilizando "tijeras génicas" –CRISPRs– para modificar el genoma de embriones producidos in vitro pudieron editar el gen de la beta-lactoglobulina, principal alérgeno presente en la leche bovina

A poco más de seis años de que la ternera Rosita ISA diera leche con características similares a la humana, debido a la presencia de las proteínas lisozima y lactoferrina, el mismo equipo de investigadores del INTA y de la Universidad Nacional de San Martín identificó el gen de la beta-lactoglobulina en embriones bovinos y, a partir del uso de "tijeras génicas" –CRISPRs–, logró introducir cambios en el genoma de bovinos de raza lechera.

El hallazgo se confirmó en tres de los cuatro animales en estudio, que manifestaron distintos tipos de edición del gen de la beta-lactoglobulina, principal alérgeno presente en la leche bovina. Son los primeros animales obtenidos en el país como resultado de la generación de una plataforma completa de edición génica y es la primera vez que se aplica esta tecnología en este gen en el mundo.

El objetivo final "es obtener un animal productor de leche hipoalergénica, que no tenga la capacidad de producir esa proteína que genera esta afección", explicó Nicolás Mucci, investigador del grupo de Biotecnología del INTA Balcarce –Buenos Aires–, responsable del proyecto llevado a cabo en el marco de su tesis doctoral.

"Nuestro trabajo busca apagar y sacar el alérgeno más importante que tiene la leche de vaca para el ser humano, como es la beta-lactoglobulina; una proteína que corresponde al 50 por ciento de todas las proteínas del suero de la leche", indicó Adrián Mutto, investigador de la UNSAM y del Conicet.

Para que la edición génica se concrete y se pueda producir efectivamente leche sin beta-lactoglobulina, se deben obtener animales homocigotas no mosaico, es decir, que presenten la edición en ambas copias del gen y en todas sus células.

Del total de transferencias embrionarias realizadas a hembras receptoras, entre los meses de marzo y noviembre de 2017, se lograron nacimientos entre febrero y julio de este año y fueron cuatro terneras.

Según los análisis de alineación de las secuencias amplificadas y de comparaciones con secuencias consenso (control), se verificó que la primera ternera no registró modificaciones en el genoma, mientras que la segunda y la tercera mostraron la edición del gen en uno de los alelos y no en todas sus células. En tanto, la cuarta fue la única que manifestó la edición en uno de los alelos en todas sus células.

"Si bien aún no logramos la obtención de un animal homocigota no mosaico, que hubiera sido el resultado óptimo desde el punto de vista tecnológico, las terneras nacidas abren la posibilidad de conseguir el genotipo buscado a través del cruzamiento con un macho homocigota o heterocigota", sostuvo Germán Kaiser, investigador del INTA Balcarce.

En esta línea, Mucci remarcó la importancia de los resultados de la experiencia como precedentes en el campo científico.

"Hasta el momento, no existen informes de bovinos editados en este gen a partir del uso de CRISPR en el mundo", puntualizó el investigador, al tiempo que agregó: "Estos animales son los primeros obtenidos en el país como resultado de la generación de una plataforma completa de edición génica, en el marco del primer y único proyecto que cuenta con el estatus de no regulado por parte de la Dirección Nacional de Biotecnología".

Según los investigadores, con quienes colabora Pablo Ross desde la Universidad de California en Davis (institución de los Estados Unidos que había confirmado la obtención de los primeros embriones editados genéticamente de la Argentina), estos nacimientos permitirán multiplicar esta genética y dar origen a futuros rodeos de vacas de la raza Holando Argentino que produzcan leche hipoalergénica para ser consumida sin inconvenientes.

En la actualidad, el equipo se encuentra a la espera de los resultados de 40 transferencias efectuadas a hembras receptoras, mientras concluye la estrategia para reeditar las células de la ternera heterocigota no mosaico y transformarlas en homocigotas. "Una vez obtenidas estas células, se podrán generar animales mediante clonación por transferencia nuclear que serán genéticamente idénticos a esta ternera, pero, dada la edición completa del gen, será posible producir leche hipoalergénica", adelantó Mucci.

Para que la edición génica se concrete y se pueda producir efectivamente leche sin beta-lactoglobulina, se deben obtener animales homocigotas no mosaico, es decir, que presenten la edición en ambas copias del gen y en todas sus células.

Jornada científica

"Todo lo querías saber sobre edición génica y no te animabas a preguntar" es el primer evento de alcance nacional, dedicado a presentar el panorama actual en cuanto a sus aplicaciones científicas tanto en el ámbito agropecuario como en la salud humana, el marco regulatorio y su perspectiva a futuro. Con la participación de destacados especialistas, la jornada es organizada por las Secretarías de Gobierno de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva, Agroindustria y Salud de la Nación, INTA, CONICET y ANLIS.

"La Argentina es líder en biotecnología y hoy tiene el desafío de acercar nuevas tecnologías a la actividad agroindustrial para que el país produzca más y mejor", aseguró Luis Miguel Etchevehere, secretario de Agroindustria de la Nación, quien presidió la apertura del encuentro que se realiza hoy en el Centro Cultural de la Ciencia, junto con Lino Barañao, secretario de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva de la Nación.

Agradecido por la presencia del público, Etchevehere destacó el potencial de la edición génica: "Es una herramienta que nos permitirá desarrollar tecnología agropecuaria para producir más alimentos de calidad y, así, convertirnos en el supermercado del mundo".

Asimismo, resaltó que el trabajo y compromiso de la Argentina para promover la primera regulación específica de productos de edición génica, que ya fue tomada por otros países como Brasil, Chile y Colombia. "Nos propusimos hacer un sistema jurídico seguro y de sencilla aplicación para que sea accesible el registro de un evento biotecnológico, y sentó un precedente a escala mundial", apuntó Etchevehere.

A su turno, Barañao hizo hincapié en las oportunidades que abre la edición génica para el desarrollo agropecuario. "Vamos hacia una agricultura que será genéticamente modificada en el futuro y, en este contexto, la edición génica es una herramienta que ayudará a lograr una actividad agrícola más sustentable", indicó.

Además, alentó la apertura de líneas de investigación para explorar el potencial de esta tecnología e impulsar innovaciones que contribuyan a "sociedades más justas".

Por su parte, Juan Balbín, presidente del INTA, celebró la realización de este encuentro científico y la divulgación de las nuevas tecnologías de mejoramiento genético, cuyo estudio tiene una larga historia en el instituto.

"A lo largo de los años, el INTA ha logrado avanzar en la investigación de tecnologías de vanguardia y construir una base de conocimiento destacada en el mundo, que le permite hoy día profundizar la exploración de otras herramientas", sostuvo Balbín.

En un repaso rápido, el presidente del INTA recordó los primeros avances que introdujo la mutagénesis y sus aplicaciones en el desarrollo de resistencias a factores productivos adversos y tolerancias a herbicidas y, posteriormente, los aportes que emergieron desde la biotecnología para el mapeo y la introducción de genes. "Ahora la oportunidad viene de la mano de la edición génica y está orientada a silenciar una determinada característica no deseable en cualquier expresión vegetal o animal o microbiana", explicó.

Para Balbín, "más allá de las herramientas que toman fuerza en cada momento, el concepto más importante es observar cómo ha evolucionado inteligentemente la investigación científica-técnica en el INTA en el sentido de que se han aprovechado todas las nuevas potencialidades sin abandonar el conocimiento adquirido".

De esta manera, Balbín explicó que, por ejemplo, la edición génica es posible gracias a la base científica previa y a los aprendizajes generados por el resto de las tecnologías. "Lo inteligente es cómo se coordinan las herramientas de mejoramiento genético, para que, entre todas, construyan un pool de conocimiento que nos permita seguir en la discusión por los avances tecnológicos de los próximos 20 años", enfatizó.

No son terneros transgénicos

"Estos terneros se diferencian de Rosita ISA", dijo Mutto, y agregó: "No son transgénicos, no tiene ningún agregado en forma artificial".

De acuerdo con el investigador, lo único que hicieron fue una modificación en el genoma. En realidad, "lo hizo la propia vaca, al usar sus propios mecanismos para silenciar ese gen una vez que efectuamos un corte en su secuencia", explicó. En otros términos, se trató de una intervención que consistió en inducir a que apague ese gen.

Y aunque lo lograron parcialmente, continúan trabajando en impedir la formación de esa proteína durante la lactancia de la vaca. En esta tarea, aplican la técnica denominada CRISPR o "tijera genética" que les permite editar el genoma directamente y cortar el gen de la beta-lactoglobulina en embriones bovinos para modificar su secuencia.

La herramienta genera un corte en el ADN donde es requerido y la propia maquinaria celular intenta repararlo. "Debido a que no posee la información para agregar en el segmento del corte y repararlo tal cual estaba, genera una cicatriz que es, precisamente, la responsable de generar un cambio de lectura del ADN que lleva a que el gen se apague y que la proteína beta-lactoglobulina no se encuentre en la leche de vaca", explicó Mucci, quien se especializó en la generación de "bovinos knock outs" –llamados así por la inactivación de genes específicos– mediante la tecnología de edición génica y mediada por CRISPR-CAS 9.

De todos modos, "no todos los animales que nacen tienen la edición que deseamos", aclaró Kaiser. Esto se debe a que la probabilidad de éxito "de la población de embriones generados con CRISPR que desarrollarán la modificación genética deseada ronda entre un 30 a 40 por ciento", sostuvo. 

La importancia de terneras editadas

Desde el punto de vista regulatorio, "generar edición génica y, particularmente, silenciamiento génico es ventajoso para la investigación en el país", subrayó Mucci, ya que los costos económicos que deben afrontarse durante el proceso de estudio son menores.

Si se puede demostrar que "no se agregó ninguna secuencia foránea, ese animal no es considerado genéticamente modificado y puede ser manejado en un campo con otros animales". A diferencia de lo que sucede con un animal transgénico que, de acuerdo con la regulación vigente, "debe manejarse en condiciones de confinamiento", apuntó.

Actualmente es el único proyecto en el país "con este grado de avance y con el estatus de animales no regulados", expresó el investigador, tras referir que fueron autorizados según la nueva reglamentación aprobada a finales del 2017 por la Dirección Nacional de Biotecnología del Ministerio de Agroindustria.

Al ser animales a los que se les indujo un pequeño cambio en la secuencia de su ADN, sin agregado de genes o secuencias de origen foráneo –de otra especie–, no son considerados genéticamente modificados, según la mencionada Dirección y la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (Conabia).

Diez años de investigaciones

Los primeros diseños biotecnológicos y estudios bioinformáticos para generar este silenciamiento los hicieron junto con Ross en los Estados Unidos. Ya en 2014, en la Universidad Nacional de San Martín y en el INTA Balcarce, se avanzó en el desarrollo y puesta a punto de la técnica CRISPR para efectuar el silenciamiento en embriones bovinos producidos por fecundación in vitro.

Desde el punto de vista técnico, comenzaron con la identificación de la secuencia del gen que querían alterar. Una vez que decidieron cómo hacerlo, se proveyeron de ovarios de la raza Holando Argentino de donde obtuvieron los óvulos en el laboratorio.

Éstos fueron fecundados con semen sexado de la misma raza, porque la intención era obtener ganado lechero y, a las 16 horas de haberlos fecundados, le inyectaron las herramientas de biología molecular para que corten el ADN en el gen de beta-lactoglobulina.

Posteriormente, luego de haber obtenido los permisos correspondientes, en 2017 se realizaron las primeras transferencias embrionarias y se fueron confirmando las gestaciones.

Los antecedentes del equipo se remontan al 2009, en momentos en que iniciaban la línea de investigación en animales genéticamente modificados. Dos años más tarde, nació Rosita ISA y trascendió como un logro internacional en el mundo científico, por ser el primer bovino bitransgénico del mundo que produce dos proteínas humanas en su leche.

Esta investigación formó parte del proyecto específico "Genómica y biotecnología aplicada a la cría animal" y estuvo enmarcado en el proyecto integrador del INTA "Biotecnología y genómica aplicada al sector pecuario". Además, recibió fondos de un proyecto PICT 2015, otorgado al Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Dr. Rodolfo Ugalde del Conicet y de la UNSAM, provenientes de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) del entonces Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva de la Nación.